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テクニカルサポート
ペプチド及び抗体 テクニカルサポート
ペプチド抗体精製キット マニュアル
1.用意するもの
・溶媒１：1X PBS
・溶媒２：1X PBS with 0.1 % Tween 20
・溶媒３：0.1M Glycine (pH 2)
・溶媒４：1M Tris-HCl (pH 8)
・溶媒５：1X PBS with 0.02 % NaN3
・精製抗体回収用チューブ
・エンプティカラム ＜キット添付品＞
・抗原固定化セファロース（１ｍｌ）＜キット添付品 (5 mL チューブ内)＞
2.方法
(1) 血清の準備
血清を溶媒１で 2倍希釈します。
(2) インキュベーション
5 mL チューブ中の 抗原固定化セファロース と (1) の希釈した血清を混合し、37℃ で 1時間振とうさせた後、4℃ で 8時間置きます。
(3) カラムへの充填
エンプティカラムをカラムスタンド等に固定し、カラムの下端が密閉されていることを確認した上で、(2)の抗原固定化セファロースと血清の混合体を充填します。
(4) 非吸着画分の溶出
カラムの下端を開き、非吸着画分を溶出させ、チューブに保存します。
(5) カラムの洗浄
カラムを溶媒２（15 mL）で洗浄後、溶媒１（30 mL）で洗浄します。
※洗浄後、洗浄液の 280 nm における吸光度（A280）を確認し、 0.002 以上の場合、溶媒１で再洗浄してください。
(6) 抗体回収用チューブの準備
チューブラックに 6～8 本の回収用チューブを用意し、各チューブに 溶媒４を 200 uL 入れておきます。
(7) 抗体の溶出
カラムに 溶媒３を 5 mL 加え、溶出液を 1 mL ずつ チューブに回収します。
回収した溶出液（各チューブ）の吸光度（A280）を測定し、抗体の含まれている画分をプールします。
(8) 抗体の濃度計算
プールした精製抗体の吸光度（A280）を測定し、次の公式から濃度を算出します。
濃度（ug/mL）= A280 (1/LP) ×0.69× 1000 ※LP：光路長（cm）
(9) カラムの再生
カラムを溶媒５（10 mL）で洗浄し、洗浄液が pH７であることを確認します。
4℃で保存します。
（抗原固定化セファロースは、溶媒１の10倍希釈液とともにチューブに保管します）